登革熱病毒（DENV）是一種由蚊子傳播的黃病毒，是目前困擾*熱帶和亞熱帶國(guó)家的嚴(yán)重的蟲(chóng)媒病毒。DENV在人類和伊蚊之間的維持它的生命周期，尤其是埃及伊蚊和白紋伊蚊。蚊子可能偶然以病毒宿主為食，獲取含有DENV顆粒的血液，這些病毒顆粒會(huì)被轉(zhuǎn)移到蚊子的中腸。病毒隨后感染蚊子腸上皮，然后傳播到其他組織，例如血淋巴和唾液腺，以致被感染的蚊子能夠通過(guò)血液將病毒傳播給其他宿主。蚊子在吸血過(guò)程中將病毒宿主的大量血液吸入腸道，這是蚊子感染DENV的主要方法。宿主血液在吸血幾天內(nèi)被蚊子機(jī)體消化和代謝的同時(shí)使得腸道上皮獲病毒感染。這表明血液成分或其代謝產(chǎn)物可以直接調(diào)節(jié)腸道上皮的免疫和生理狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)蚊子對(duì)病毒的易感性。

實(shí)際上，宿主血液中的許多因素都可能會(huì)調(diào)節(jié)病原體對(duì)蚊子的感染。例如，瘧原蟲(chóng)通過(guò)脊椎動(dòng)物宿主傳播到蚊子，其配子體在蚊子中腸內(nèi)進(jìn)行有性生殖階段的發(fā)育成熟，而宿主血液中的許多因素在配子體的發(fā)育中起作用。蟲(chóng)媒病毒對(duì)蚊蟲(chóng)中腸的感染也受宿主血液成分的調(diào)節(jié)。宿主免疫應(yīng)答的變化，例如提高抗DENV包膜蛋白的免疫球蛋白滴度，可能會(huì)調(diào)節(jié)埃及伊蚊從蠕蟲(chóng)病患者獲得DENV的能力。吸食血液時(shí)，人血中的低密度脂蛋白會(huì)被埃及伊蚊的腸上皮細(xì)胞吞噬并積聚在腸上皮中，從而阻礙了DENV感染埃及伊蚊。此外，通過(guò)血液消化產(chǎn)生氨基酸谷氨酸可激活涉及神經(jīng)遞質(zhì)GABA（γ-氨基丁酸）的信號(hào)，從而促進(jìn)蚊子的免疫抑制，進(jìn)而促進(jìn)從吸食的血液中獲得病毒。除宿主血液成分外，黃病毒還可以利用其自身的非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1），這些蛋白分泌到宿主血液中可有效地克服蚊子的腸道的不利環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)病毒的獲取。然而，宿主個(gè)體之間的血液成分可能會(huì)根據(jù)其遺傳，生理和營(yíng)養(yǎng)狀況而有很大差異。

據(jù)此，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，清華大學(xué)-北京大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心程功教授，提出血液成分的變化可能是調(diào)節(jié)蚊子對(duì)DENV敏感性并確定蚊子傳播的DENV能力的外在因素的這一假設(shè)。該研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)人血清鐵在埃及伊蚊對(duì)DENV的吸收方面的影響、小鼠血清鐵水平及鐵缺乏癥小鼠中的補(bǔ)鐵在蚊子對(duì)DENV的獲取的影響等試驗(yàn)，對(duì)這一假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外和體內(nèi)模型中，血清鐵的非血紅素結(jié)合形式在蚊子腸中正調(diào)控抗病毒ROS的產(chǎn)生。蚊子鐵代謝利用從人血中獲取的鐵來(lái)下調(diào)腸道上皮中抗氧化劑基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致強(qiáng)大的ROS反應(yīng)。該項(xiàng)研究結(jié)果對(duì)蚊子吸食血液激活的ROS提供了一個(gè)機(jī)制上的見(jiàn)解。該研究成果已發(fā)表在Nature Microbiology期刊上，IF=14.174。博士后朱毅斌為一作者，程功教授為該文章的通訊作者。

題目：

Host serum iron modulates dengue virus acquisition by mosquitoes

期刊：Nature Microbiology

影響因子：14.174

PMID：31527795

一作者：

博士研究生朱毅斌

作者單位：清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院

索萊寶合作產(chǎn)品：

吸血是蚊子感染蟲(chóng)媒病毒的主要途徑。血液代謝物成分可以調(diào)節(jié)蚊子對(duì)蟲(chóng)媒病毒的敏感性。該研究報(bào)告了人類血液中的血清鐵對(duì)蚊子獲取登革熱病毒的影響。埃及伊蚊對(duì)登革病毒的感染率與供者血清鐵濃度呈負(fù)相關(guān)。在小鼠-蚊子獲取模型中，補(bǔ)鐵可降低登革病毒感染率和病毒載量，而中和血清鐵可促進(jìn)埃及伊蚊的登革病毒感染。值得注意的是，以缺鐵（鐵缺乏癥）小鼠為食的蚊子出現(xiàn)較高的登革熱病毒感染率。宿主缺鐵狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)在很大程度上減少了蚊子對(duì)登革熱病毒的獲得和感染。蚊子的鐵代謝途徑利用的是血清鐵而不是血紅素結(jié)合鐵，從而提高了腸道上皮中活性氧的活性，進(jìn)而抑制登革熱病毒的感染。根據(jù)這些結(jié)果，人群中缺鐵的狀況可能有助于對(duì)登革熱病毒的矢量放縱，從而促進(jìn)其通過(guò)蚊子傳播。

1、人血清鐵抑制埃及伊蚊對(duì)DENV的吸收

隨機(jī)收集了60份人類血液樣本，通過(guò)體外血液喂養(yǎng)系統(tǒng)向埃及伊蚊喂食含有人類血液和DENV-2感染的Vero細(xì)胞上清液的混合物對(duì)這一個(gè)假設(shè)進(jìn)行研究。結(jié)果表明人類血液的質(zhì)量和成分可以調(diào)節(jié)蚊子對(duì)DENV的吸收。接下來(lái)檢測(cè)了供體血清樣本中的12種基本血液成分，并評(píng)估它們與蚊子中DENV含量的相關(guān)性。鐵濃度與埃及伊蚊的DENV-2感染呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)用去鐵胺（DFX）（一種結(jié)合并從血清中去除鐵的化合物）來(lái)特異性中和人血樣品中的血清鐵，從而增加了埃及伊蚊的DENV感染率。口服檸檬酸鐵銨（FAC）（一種常用的鐵補(bǔ)鐵試劑）進(jìn)行治療，體外喂養(yǎng)血液或DENV-2感染的Vero細(xì)胞對(duì)埃及伊蚊的感染率均降低。相反，口服DFX治療會(huì)增加埃及伊蚊的DENV患病率和病毒載量。

在生理?xiàng)l件下，血漿中循環(huán)的無(wú)機(jī)鐵主要與運(yùn)鐵蛋白結(jié)合。該研究的人血清樣本中的轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度值均低于70％，這表明血樣是從具有穩(wěn)定的鐵的供體中采集的。該研究團(tuán)隊(duì)預(yù)測(cè)這些血液樣本中會(huì)存在非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的無(wú)機(jī)鐵。因此，他們通過(guò)口服接種含鐵人轉(zhuǎn)鐵蛋白（全轉(zhuǎn)鐵蛋白），重新評(píng)估了血清鐵在蚊子的DENV感染中的作用。與FAC治療的結(jié)果一致，口服轉(zhuǎn)鐵蛋白的埃及伊蚊降低了DENV的患病率和病毒載量。

與血清中的鐵相反，紅細(xì)胞中的大多數(shù)鐵與血紅素結(jié)合。值得注意的是，埃及伊蚊的血紅素鐵濃度與DENV流行之間沒(méi)有顯著相關(guān)性。血清鐵和血紅素鐵是通過(guò)蚊子中不同的途徑被利用，從而導(dǎo)致不同的生理結(jié)果。他們?cè)u(píng)估了血紅素在蚊子中DENV感染的作用。與血紅素一起孵育對(duì)感染細(xì)胞中的病毒載量并沒(méi)有影響。接下來(lái)，他們研究了血紅素在DENV蚊子感染中的作用。蚊子直接暴露于血紅素中可導(dǎo)致DENV流行程度的輕度降低，這表明人血中的血紅素鐵可能在調(diào)節(jié)DENV對(duì)蚊子感染中沒(méi)有顯著作用。

2、小鼠血清鐵水平影響蚊蟲(chóng)對(duì)DENV的獲取

接下來(lái)，他們利用小鼠-蚊子捕獲模型來(lái)評(píng)估血清鐵在蚊子捕獲DENV中的作用。AG6小鼠（一種缺乏I型和II型干擾素受體（ifnagr-/-）的C57BL / 6小鼠）已被用作DENV感染的動(dòng)物模型。在這里，AG6小鼠皮下感染DENV。接種病毒兩天后，感染的小鼠受到埃及伊蚊叮咬15分鐘。然后立即給小鼠靜脈內(nèi)注射全鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為鐵的補(bǔ)充劑。留置15分鐘使鐵在血液中擴(kuò)散，然后將經(jīng)過(guò)治療的小鼠再次被蚊子叮咬。兩個(gè)連續(xù)叮咬之間的時(shí)間短暫，可避免蚊子在吸食血液中獲取病毒顆粒數(shù)量的變化。全轉(zhuǎn)鐵蛋白接種后，小鼠血清中的鐵濃度顯著增加，而病毒在此短時(shí)間內(nèi)沒(méi)有變化。在全轉(zhuǎn)運(yùn)鐵蛋白治療的小鼠中，埃及伊蚊的DENV感染率和病毒載量大大降低。

接下來(lái)，他們?cè)u(píng)估了小鼠循環(huán)中血清鐵的消耗是否會(huì)改變DENV的獲取。靜脈內(nèi)接種DFX可以從受感染小鼠的血清中去除鐵，而這種治療并不能改變小鼠的DENV病毒血癥。以DFX處理和感染的小鼠為食的蚊子中DENV的患病率比以模擬治療感染小鼠為食的蚊子高得多，這表明血清鐵不會(huì)影響宿主體內(nèi)DENV病毒血癥的水平，但會(huì)通過(guò)吸食血液影響蚊子獲得DENV。

3、蚊子的鐵代謝途徑通過(guò)活化腸道上皮中活性氧的活性抑制了DENV的感染

蚊子吸收鐵的兩個(gè)主要來(lái)源是血清和紅細(xì)胞中的血紅素。食物中的血清鐵與蚊子中的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合并被運(yùn)輸?shù)轿米蛹?xì)胞中。此外，血清鐵可以通過(guò)二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（DMT1）或其他未知轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白導(dǎo)入昆蟲(chóng)腸道上皮。除血清無(wú)機(jī)鐵外，溶血也導(dǎo)致細(xì)胞外血紅素和血紅蛋白的存在。人血漿中的血紅素可能通過(guò)稱為血紅素載體蛋白1（HCP1）的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。血紅素也可以與血紅蛋白形成復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。血清中的血紅蛋白與結(jié)合珠蛋白相互作用，用于下游鐵代謝。隨后，血紅蛋白和血紅蛋白血紅素加氧酶1（HO1）在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行處理，釋放出無(wú)機(jī)鐵以進(jìn)行循環(huán)利用。通過(guò)這些途徑從血液中獲取的鐵可能被存儲(chǔ)在蚊子細(xì)胞的鐵蛋白中。在埃及伊蚊中，DMT1、血凝蛋白或結(jié)合珠蛋白的人類基因沒(méi)有同源性；然而，在埃及伊蚊中已鑒定出人類轉(zhuǎn)鐵蛋白（AaTransferrin），鐵蛋白（AaFerritin）、HCP1（AaHCP1）和HO1（AaHO1）基因的同源基因。接下來(lái)，他們研究了鐵蛋白在DENV感染中的作用。沉默埃及伊蚊鐵蛋白H（AaFerritin H）基因可減少DENV復(fù)制；而伊蚊鐵蛋白H（AaFerritin H）的異位表達(dá)會(huì)增加Aag2細(xì)胞中的病毒載量。敲除伊蚊鐵蛋白H（AaFerritin H）基因可降低DENV對(duì)埃及伊蚊的感染。

接下來(lái)，他們?cè)u(píng)估了這些蚊子轉(zhuǎn)鐵蛋白在DENV獲取中的作用。在埃及伊蚊基因組中鑒定到四個(gè)鐵轉(zhuǎn)蛋白（AaTransferrin）基因。沉默單個(gè)鐵轉(zhuǎn)蛋白基因（AaTransferrins）可適度增強(qiáng)蚊子的DENV感染；同時(shí)敲除這四個(gè)基因?qū)е掳＜耙廖弥懈叩腄ENV感染率和病毒載量，表明這些鐵轉(zhuǎn)蛋白基因（AaTransferrins）在蚊子鐵代謝中具有協(xié)同作用。他們接下來(lái)在果蠅表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和純化鐵轉(zhuǎn)蛋白基因（AaTransferrin）。口服這種轉(zhuǎn)鐵蛋白可以減少蚊子的DENV載量。

血紅素中的鐵或許可以被運(yùn)輸?shù)轿米蛹?xì)胞中，然后由血紅素加氧酶釋放，以通過(guò)蚊子的鐵代謝進(jìn)行再循環(huán)。因此，他們推測(cè)血液降解產(chǎn)生的血紅素可能被HCP1轉(zhuǎn)運(yùn)到蚊子細(xì)胞中，而鐵可能被HO1在到細(xì)胞內(nèi)循環(huán)利用。但是，沉默AaHCP1或AaHO1基因不會(huì)影響埃及伊蚊中DENV感染和的活性氧（ROS）的積累。血紅素代謝系統(tǒng)在蚊子體內(nèi)的功效很低，表明血紅素鐵可能在調(diào)節(jié)DENV感染中沒(méi)有重要作用。

接下來(lái)，他們研究了血清鐵抑制蚊子獲得DENV的機(jī)制。解剖經(jīng)FAC處理或未經(jīng)FAC處理的人血喂養(yǎng)的蚊子中腸，進(jìn)行RNA測(cè)序（RNA-seq）分析。選擇免疫信號(hào)成分，酶和效應(yīng)物進(jìn)行分析。

在用FAC處理的人血喂食蚊子后，29個(gè)基因的表達(dá)水平在24h時(shí)改變了4倍以上，51個(gè)基因在48h時(shí)改變了4倍以上。經(jīng)FAC處理的血液喂養(yǎng)的蚊子中腸和對(duì)照組蚊子的中腸的RNA干擾，Toll，免疫缺陷和Janus激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活劑（JAK-STAT）信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及編碼抗菌肽（AMPs）的基因水平均沒(méi)有顯著差異。然而，根據(jù)RNA-seq分析的結(jié)果，在埃及伊蚊的腸上皮中，多種埃及伊蚊過(guò)氧化氫酶（AaHPX）和超氧化物歧化酶（AaSOD）基因的表達(dá)被全面下調(diào)了4-13,000倍。用定量PCR方法驗(yàn)證了這些基因在喂血48h后的變化。實(shí)際上，HPX和SOD都作為調(diào)節(jié)因子，通過(guò)去除由產(chǎn)生ROS的酶和代謝活性合成的過(guò)量ROS來(lái)阻止ROS活性。ROS的激活是限制蚊子中DENV感染的關(guān)鍵。因此，他們推測(cè)從人血清中獲得的鐵可能會(huì)降低這些H2O2分解酶的表達(dá)，從而增加ROS的活化。剔除這些基因會(huì)嚴(yán)重影響DENV對(duì)埃及伊蚊的感染。沉默AaHPXs和AaSODs可以增加ROS的活性。此外，通過(guò)口服FAC補(bǔ)充可提高埃及伊蚊腸道中ROS的活性，而對(duì)AaFerritin H基因的抑制可以增強(qiáng)蚊子上皮細(xì)胞的ROS反應(yīng)。FAC介導(dǎo)的補(bǔ)鐵通過(guò)ROS激活提高了蚊子對(duì)DENV感染的抵抗力，而用乙酰半胱氨酸抑制ROS活性可恢復(fù)FAC處理過(guò)的蚊子的DENV載量和ROS活性。他們?cè)u(píng)估了口服人體單個(gè)血液樣本的蚊子中腸的ROS反應(yīng)。人血清中的鐵濃度與腸道上皮中的ROS活性呈正相關(guān)，表明血清鐵通過(guò)誘導(dǎo)蚊子腸上皮中的ROS活性而阻礙DENV復(fù)制。

4、鐵缺乏癥小鼠中的補(bǔ)鐵降低了蚊子對(duì)DENV的獲取

鐵缺乏癥是登革熱流行國(guó)家常見(jiàn)的公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此，他們?cè)u(píng)估了鐵缺乏狀態(tài)是否可以調(diào)節(jié)蚊子中DENV的發(fā)病率。先，他們建立了長(zhǎng)期缺鐵AG6小鼠模型。用無(wú)鐵飲食喂養(yǎng)AG6小鼠五周。正常飲食的小鼠充當(dāng)模擬對(duì)照。食用無(wú)鐵飲食后，糞便和血清中的鐵濃度逐漸降低。接下來(lái)，他們用DENV-2皮下感染AG6小鼠。DENV-2感染后第1天第5天，感染的小鼠每天受到蚊子叮咬（云南瑞麗毒株）。與以正常飲食喂養(yǎng)的小鼠相比，無(wú)鐵飲食不會(huì)影響DENV病毒血癥。以鐵缺乏小鼠為食，可提高埃及伊蚊的DENV患病率和病毒載量。接下來(lái)，他們又利用Aegypti Mengla毒株（另一個(gè)田間蚊子群）進(jìn)一步研究宿主鐵在調(diào)節(jié)蚊子中DENV感染中的作用。小鼠的無(wú)鐵飲食對(duì)DENV病毒血癥沒(méi)有顯著影響。小鼠鐵缺乏的狀況促進(jìn)了埃及伊蚊通過(guò)吸食血液獲得DENV。

接下來(lái)，他們研究了缺鐵小鼠中補(bǔ)鐵是否可以通過(guò)田間蚊蟲(chóng)來(lái)調(diào)節(jié)DENV的獲取。他們通過(guò)腳墊將DENV-2皮下注射感染了缺鐵的AG6小鼠。每天向感染的鐵減少癥小鼠靜脈內(nèi)注射FAC或PBS，然后使其受到蚊子叮咬。補(bǔ)鐵可增加小鼠血清中的鐵濃度。小鼠病毒血癥不受FAC處理的調(diào)節(jié)。鐵缺乏癥小鼠血清鐵濃度的升高降低了蚊中腸和唾液腺的DENV患病率。他們將埃及伊蚊門(mén)格拉株與鐵缺乏癥小鼠用于隨后的研究。小鼠血清鐵濃度的增加會(huì)降埃及伊蚊門(mén)格拉株的DENV患病率和全身及唾液中的病毒載量。

他們?cè)u(píng)估了補(bǔ)鐵對(duì)蚊子在低鐵人類血液樣本中對(duì)DENV獲取的調(diào)節(jié)機(jī)制。人血清中的正常鐵濃度范圍從大約0.5到2.5μgml^-1。選擇了十八份血清鐵濃度低于0.55μgml^-1的血液樣本進(jìn)行研究。血清中的鐵濃度分別增1.5μgml^-1和μgml^-1。血清鐵濃度的升高以濃度依賴性的方式降低了蚊子的DENV患病率。血清鐵濃度增加2.5μgml^-1*消除了以五個(gè)血樣為食的蚊子對(duì)DENV的獲取，這表明宿主體內(nèi)鐵缺乏癥的改善可能會(huì)降低蚊子對(duì)DENV的傳播。

本研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)一系列試驗(yàn)篩選，發(fā)現(xiàn)宿主血清中鐵離子含量與蚊蟲(chóng)吸血獲取病毒的能力呈高度負(fù)相關(guān)關(guān)系，證明宿主血清鐵離子濃度是阻抑蚊蟲(chóng)獲取病毒感染的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因素。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，血清中鐵離子進(jìn)入蚊蟲(chóng)腸道后，可被腸道細(xì)胞的鐵代謝系統(tǒng)直接利用，抑制細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶基因表達(dá)，導(dǎo)致蚊蟲(chóng)腸道中活性氧(ROS) 水平大幅提高，終阻抑病毒在蚊蟲(chóng)體內(nèi)的感染擴(kuò)增。該研究結(jié)果揭示向登革病毒疫區(qū)的人群中普遍補(bǔ)鐵是切斷登革病毒在自然界中傳播的一種有效手段，補(bǔ)鐵將為登革病毒防治提供全新的防控思路和策略。

備注

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