蛋白質分析技術(Western Blot、ELISA、免疫熒光與免疫組化技術)

1 原理：

將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進行反應，洗滌去除沒有結合的特異性抗體后，加入標記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應一段時間后再次洗滌去除非特異性結合的標記抗體，加入適合標記物的檢測試劑進行顯色或發光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現，也可通過條帶的密度大小來進行特異性蛋白的半定量。 

2 操作過程

SDS-PAGE電泳→轉膜（PVDF或硝酸纖維素膜）

封閉→一抗→洗滌→酶標二抗反應

洗滌→顯色或化學發光顯影

Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20mM of gossypol for 4, 8 

and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control.

Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody.

3 注意的問題

（1） 蛋白質電泳

常用SDS-PAGE：單一亞基組成的蛋白質

非變性PAGE：多個不同亞基組成的蛋白質

Tris-Tricine膠中電泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。

（2）轉膜

戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因為手上的油脂會阻斷轉印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致

以適量的轉移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜15－30min，如果是PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。

方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極

排去濾紙、膠和膜間的氣泡。

電轉時間：100V 1-2h,可根據蛋白分子量的大小靈活 選擇轉移結束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉移效率膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標準的位置

（3）封閉

用5％脫脂奶粉或3％BSA

（含0.1％Tween20 TBS或PBS配制）

時間：室溫2h或4ºC隔夜

（4）顯色或顯影

顯色

辣根過氧化物酶：底物為DAB

堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBT

化學發光顯影

常用。辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發光底物（商品化產品）

注意：化學發光前將膜用不含Tween20的TBS或PBS洗滌一次曝光的時間和顯影的時間根據實際情況而定

（5）膜的再利用

化學發光后的硝酸纖維素膜用Stripping Buffer洗滌后（洗滌Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的? －2ME ）   用不同的一抗進行雜交，檢測其它蛋白的表達情況。一張膜可以重復使用3－4次。堿性磷酸酶顯色的膜不能再進行雜交

二、ELISA

1 原理：

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復性好。 

ELISA 常用的酶和底物 

辣根過氧化物酶，底物為OPD, 深桔黃色 ，檢測波長492nm

                  TMB， 藍綠色，檢測波長450nm

  堿性磷酸酶，底物為PNPP（對－消基苯磷酸酯）, 黃色 

              檢測波長405nm

  ELISA各步驟的反應時間

  包被：24－36h，蛋白濃度為1－5ug/ml

  封閉：37ºC 2h 或4ºC隔夜（3％BSA）

  樣本反應時間：37ºC 45min-1h

  酶標抗體反應時間： 37ºC 45min-1h

  顯色時間：15min(避光）

  設對照

可以一次包被多塊板，凍存備用

2 類型

（1）間接法測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體，檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。 

常用于臨床血清中自身抗體的檢測，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測。

(2) 雙抗體夾心法測抗原

是檢測抗原常用的方法。

只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物。

常用的組合：單克隆抗體＋多克隆抗體

              單克隆抗體＋單克隆抗體 

后一組合是兩種單克隆抗體針對抗原上不同的相距較遠的兩個抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結合物。

用途：測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。例如各種細胞因子的檢測。 

雙抗體夾心法測抗原的方法：

捕獲抗體包被→封閉（3％BSA）→待測抗原→洗滌（含0.1％Tween的PBS)→酶標單抗或多抗→洗滌→顯色→檢測

(3)競爭法測抗原

1）抗體固相測抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。

其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，后的顯色也愈淺。

方法：抗體包被→封閉→同時加入待測抗原和酶標抗原→洗滌→酶底物→顯色→ELISA reader檢測

2）抗原固相測抗原

其原理是標本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競爭結合。標本中抗原含量愈多，結合在固相上的抗體愈少，后的顯色也愈淺。 

方法: 

a: 抗原包被96孔板；   b:封閉; 

c: 待測抗原與抗體反應一定時間；   d: 加入96孔板 

e: 洗滌                 f：加入酶標二抗 

g：洗滌               h：顯色和檢測 

（4）IgM抗體的檢測 

1）間接法： 

間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定血清中的IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結合到固相上，將出現假陰性結果。 因此，如果用抗IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。 

方法：

a: 抗原包被96孔酶標板；   b:封閉; 

c: 待測血清與A蛋白反應一定時間后離心 

d:   吸取上清液加入96孔酶標板 

e: 洗滌                 f：加入酶標抗IgM的抗體 

g：洗滌               h：顯色和檢測 

2）捕獲包被法（夾心法） 

先用抗人IgM抗體包被ELISA板，以捕獲血清標本中的IgM（包括針對抗原特異性的IgM和非特異性的IgM)。然后加入相應抗原，繼而加入針對抗原特異的酶標抗體，再與底物作用，顏色的深淺即與標本中的IgM含量成正相關。 

方法： 

a: 抗人IgM抗體包被96孔酶標板；   b:封閉; 

c: 加入待測血清；     d:   洗滌96孔酶標板 

e: 加入相應抗原         f：加入抗原特異的酶標抗體 

g：洗滌               h：顯色和檢測 

（5） ABS-ELISA技術 （Avidin Biotin system-ELISA 

原理 

親和素是一種分子量是60，000的堿性蛋白，由四個相同亞基組成，每個亞基有一個生物素分子結合點。兩者均可與抗體等大分子生物活性物質相偶聯，又可被酶類等多種材料所標記，成為一種生物反應放大系統。生物素化抗體可捕獲多個親和素，后者再與酶結合，加入底物后，產生顏色反應。這一系統可以大大提高ELISA的靈敏度。   

操作過程： 

抗原包被→封閉→待檢標本→生物素化抗體→洗滌→ 酶標記親和素→洗滌→加底物顯色和檢測 

三 免疫熒光技術 

利用某些熒光素，如FITC、R-PE等通過化學反應與抗體或其它蛋白結合制備成熒光探針，然后與被測抗原或配體發生特異性結合，形成的熒光復合物在一定波長光的激發下可產生熒光，因此利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測未知抗原或相應配體。

（一）細胞膜蛋白分子的檢測

原理：

細胞膜表面的抗原或受體可特異地與相應的抗體或配體結合，將針對細胞表面抗原的抗體或配體用不同的熒光素標記，根據不同熒光物質的大激發和發射波長的不同，即可準確定量每種熒光物質的強度，從而推出相應細胞表面抗原表達量

1 直接法：細胞＋熒光素標記的抗CD分子的抗體→4ºC反應30-60min→熒光顯微鏡觀察或流式細胞計分析。

2 間接法：細胞＋抗CD分子的抗體→4ºC 反應30-60min 熒光素標記的二抗 4ºC 反應30-60min→熒光顯微鏡觀察或流式細胞計分析

懸浮細胞：用PBS洗二次后再做染色 

貼壁細胞：先用胰酶消化成懸浮細胞再染色 

2 Annexin V檢測技術 (檢測細胞凋亡的一個常規指標)

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

樣本處理和染色方法

1 懸浮細胞的染色：將正常培養和誘導凋亡的懸浮細胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測（一般不超過1h）， 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。 

2 貼壁培養的細胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細胞。 

3 爬片細胞染色：同上，后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。 

（二）細胞內蛋白分子的檢測

細胞內細胞因子的檢測、凋亡相關蛋白TFAR19的檢測等。

操作過程： 

（1）直接法： 

細胞→3％多聚甲醛固定和 滲透化→封閉→熒光素標記的抗體→ 洗滌→熒光顯微鏡觀察或流式細胞計分析   

（2）間接法： 

細胞→3％多聚甲醛固定和滲透化→封閉→針對蛋白的特異抗體→洗滌→熒光素標記的二抗→洗滌 → 熒光顯微鏡觀察或流式細胞計分析 

凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析 

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在上先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發現，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現快速核轉位現象。同時我們發現，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現TFAR19高表達和核轉位。這為研究細胞凋亡早期所發生的事件，提供了一種新的技術和指標。

1 懸浮細胞的染色：

（1）收獲正常和誘導凋亡的細胞（0.5~1×106），PBS洗2次， 

（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，

（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應30min。

（5）加入 FITC標記的TFAR19單抗，4°C反應30min

（6）熒光細胞洗液洗2次，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位。同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度。

2：貼壁細胞的原位染色

（1） 貼壁生長的對數期細胞鋪在24孔或6孔板中（內有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到50%~80%滿時，凋亡誘導劑處理細胞。

（2） 將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色，染色步驟同上。

（3） 將染色的爬片細胞放于一張滴有少量甘油（5ul）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細胞中的定位。

四免疫組織化學技術

原理：

是指酶標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的成色反應，對相應的抗原進行定性、定位和定量測定的一項技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙的結合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡等）的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質（如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等），并可在原位顯示相應的基因和基因表達產物。

免疫組化染色技術的分類

免疫熒光法（Immunofluorescence technique）

免疫酶法（Immunoperoxidase technique）

免疫金銀法（（Immunogold technique）

ABC法（ Avidin-Biotin Complex）

五 蛋白質與蛋白質相互作用的研究技術

1 GST融合蛋白進行Pulldow實驗 

  （1）原理

  細菌表達的谷胱甘肽s－轉移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結合，然后根據谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在得到目標蛋白的抗體前，或發現抗體干擾蛋白質－蛋白質之間的相互作用時，可以啟用GST沉降技術。該方法只是用于確定體外的相互作用。

  兩種應用：

  1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用

  2）證實探針蛋白與已知蛋白質間可疑的相互作用   

（2）方法：

  1） GST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育（a, 單一明確的重組蛋白；b，細胞裂解蛋白混合液；c, 體外翻譯cDNA表達得到的未知蛋白）

  2）混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應 4ºC 2h

  3）離心棄上清

  4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，離心

  5）取上清進行SDS-PAGE電泳，

  6）考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進一步做質譜分析確 定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做Western Blot來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白

該實驗設立GST對照，反應均在4ºC進行

2 免疫共沉淀

（1）原理

當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。

如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。

這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合，也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔

缺點：可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質－蛋白質相互作用

免疫共沉淀檢測蛋白質的原理和常見問題

（2）方法

1) 收獲培養的細胞（1×107－1×108）冷PBS洗滌2次

2）細胞裂解液裂解細胞，冰浴30min

3) 12000rpm   離心 30min

4）收集上清并加入適量抗體，4ºC搖動1h

5）加入ProteinG-Sepharose懸液， 4ºC搖動1h

6）細胞裂解液洗滌ProteinG-Sepharose混合液

7）離心棄上清

8）沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5－10min

9）離心，上清液跑SDS-PAGE 膠

10）考馬氏亮蘭染色、銀染

    Western Blot     質譜分析

（3）注意的問題

1）細胞裂解

采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質－蛋白質

  相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經驗確定。

  不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。

2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用

3）使用對照抗體：

      單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗

      兔多克隆抗體：正常兔IgG

3 酵母雙雜交系統 

（1）原理：

將編碼某一蛋白X的DNA序列與DNA結合域BD的編碼序列融合形成一個雜交體，將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一個雜交體，當兩個雜交體共轉化酵母細胞（此酵母細胞上游有DNA結合位點的報告基因），若X和Y沒有相互作用，則單獨不能激活報告基因的轉錄；若X和Y可相互作用，則使BD和AD靠近形成一個有效的轉錄激活子，激活報告基因的轉錄。因此可通過檢測報告基因的轉錄來研究蛋白質X和Y的相互作用。 

1）已知蛋白之間相互作用的檢測：

2）蛋白質的功能域研究：通過對其中某一個蛋白質作缺失或定點突變，再用此系統檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關鍵氨基酸；

3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質基因與BD基因構建成“誘餌”表達質粒，將某一器官或組織的cDNA文庫與AD基因構建成“獵物”基因庫，共轉化酵母細胞，可篩到與感興趣蛋白質相互作用的蛋白質的cDNA序列，并推測其蛋白質序列。

4 蛋白質芯片

其制作原理類似于基因芯片，所不同的是，蛋白、多肽芯片所用的樣品是提純的蛋白、多肽。其檢測的原理類似于抗原、抗體檢測的ELISA法。如采用雙抗夾心的形式，可通過機械點涂的方法，將多種不同的單克隆抗體點樣固定在固相介質表面，如PVDF膜上，制備成抗體蛋白芯片，與制備的多種抗原樣本雜交、結合，芯片上的抗體捕獲相應的抗原，然后再與標記的多種不同的抗體雜交，由于抗原具有多價結合表位而結合標記抗體，根據雜交信號的有無、多少而進行定性、定量的分析。 

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